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ビタミンCによるエピジェネティクスの制御

エピジェネティクスとは

エピジェネティクスとは、『DNA塩基配列の変化を伴わない細胞分裂後も継承される遺伝子発現あるいは細胞表現型の変化を研究する学問領域』と規定される。遺伝子の変異とは異なり、エピジェネティクスは可塑性をもち、一度決定された遺伝子発現の状態が環境や生活習慣など外的要因の影響を受けて変化しうる。これらにより通常とは異なる遺伝子発現状態となり、がんや様々な疾患の発症に深く関与する。一方、近年注目を浴びているiPS細胞やES細胞が多分化能を示すのも、このエピジェネティクスの制御によるヒストンやDNA修飾のリモデリングが行われるためである。

DNAの修飾は、主にCpGのシトシン残基のメチル化に起因する。CpGの「p」の文字は、シトシンとグアニンの間のホスホジエステル結合を表す。シトシンはDNA methyltransferaseにより5位の炭素がメチル化され、5-methylcytosine(5mC)となる。一方、DNAの脱メチル化反応に関しては、近年、5mCを酸化する酵素、ten-eleven translocation 1(Tet1)が発見され、その生成物である5-hydroxymethylcytosine(5hmC)が注目されるようになった(図)1-4)。 DNAのメチル化は、遺伝子のスイッチをOFFにする遺伝子サイレンシングに関与するといわれており、受精後や発生初期段階にTetがDNAの脱メチル化を介して、そのブレーキを解除することで、遺伝子は必要に応じて活性化されると考えられている(図)。

 

図 TetによるDNAの脱メチル化

DNAの5mCはTetにより5hmCに酸化されてDNAの脱メチル化反応が駆動される。酵素活性の補因子としてビタミンC(C )及び還元鉄(Fe2+)を用いて、2-オキソグルタル酸(2-OG)と分子状酸素(O2)から、コハク酸(succinate)と二酸化炭素(CO2)が生成される。DNAがメチル化された状態では転写因子(transcription factor)が結合できず、遺伝子発現がOFFになる。 一方、ビタミンCにより、Tetが活性化するとDNAが脱メチル化されて遺伝子発現がONになる。

 

ビタミンCとエピジェネティクス

遺伝子発現の制御メカニズムに関しては、世界中の研究者たちが精力的に解析を進めており、ビタミンCも様々な遺伝子発現に関与することがin vitroおよびin vivoの実験で次第に明らかになってきている。しかし、どのような機構でビタミンCが遺伝子発現に関与しているかまでは、よくわかっていない。ところが、近年、ビタミンCがTet活性を上昇させ、遺伝子発現を調節していると相次いで報告された5)-8)

TahilianiらによるビタミンCとTet活性の最初の報告

ビタミンCとTet活性の関係が最初に報告されたのは、2009年Tahilianiら9)の研究による。Tahilianiらは、Tet1が5mCから5hmCへの酸化反応を触媒する酵素であることを同定し、さらにその酵素反応には2-オキソグルタル酸(2-OG)および 還元鉄(Fe2+)が必須であることも明らかにした。通常、2-OG、Fe2+-依存性のoxygenaseに属する酵素群の活性化には、鉄の還元状態(Fe2+)を保つため、同時にビタミンCをはじめとする還元物質が補因子として必要である。しかし、Tahilianiらの報告9)では、ビタミンCはTet1活性に影響しないという実験結果があった。この予想外の結果にTahilianiらは、反応溶液中に共存する還元剤dithiothreitol(DTT)がビタミンCマイナスの効果を補ってしまった可能性を述べている。

Minorらの報告

その後、Minorら5)はC57BL/6マウスから樹立したマウス胎児線維芽細胞(MEF)を用いて、ビタミンCがTet活性に及ぼす影響を調べた。細胞培養に用いる培養液中には、通常ビタミンCは添加されておらず、MEFの5hmCレベルは低値であった。 しかし、ビタミンCを添加すると5hmCレベルが上昇した。即ち、0~1 mMまでのビタミンCをMEFに加えたところ、10 µM添加で5hmCレベルが最大値に達した。 また、5hmCレベルはビタミンC添加後1時間から24時間まで時間依存的に上昇し、その効果は48時間まで持続した。この時、ビタミンC添加は、Tetの遺伝子発現に影響しなかった。ビタミンCのこの効果は、還元作用による可能性が推察された。 しかし、還元型グルタチオン(GSH)など他の還元物質では、5hmCレベルに影響を及ぼさなかったこと、そして細胞内へのビタミンC取り込みをphloretinにより阻害すると5hmCレベルの上昇がみられなくなったこと、さらにTet自体の発現を低下させるとビタミンC添加による5hmCレベルの上昇がみられなくなったことから、Minorら5)はビタミンCがTetの酵素活性に直接的に作用して、5hmCレベルを上昇させたと考えた。 一方、腎臓由来のHEK-293T細胞や子宮頸がん由来のHela細胞でもMEFと同様にビタミンC添加により5hmCレベルの上昇が確認された。これらのことから、多くの細胞でビタミンCはDNAの脱メチル化を介して遺伝子発現に影響を及ぼすと考えられた。

Dicksonらの報告

Dicksonら6)Minorらの報告5)を受けてMEFでのTet活性について、ビタミンCの有無に加え、さらに活性に必要なFe2+と2-OGについても調べた。Dicksonらは、ビタミンCがTet活性を上昇させる理由のひとつにビタミンCによる細胞内への鉄の取り込みの上昇を考えた。鉄はdivalent metal transporter 1(DMT1)を介して還元型(Fe2+)の形で細胞内へ取り込まれる。以前からビタミンCはFe3+をFe2+へと還元し、鉄の取り込みを促進することが報告されている10)12)。 そこで、鉄を含まない培地を用いてTetの酵素活性を調べたところ、Dicksonらの予想に反して、培地中のビタミンCの有無によりTet活性は変化したが、培地中の鉄の有無では、Tet活性に影響を及ぼさなかった。これらの結果から、Dicksonらは、Tet活性に鉄は必須でないと主張した。 しかし、Dicksonらの実験では、細胞内の鉄濃度を定量していない。したがって、少なくともTet活性に細胞外からの鉄の取り込みは必須ではないが、細胞内の鉄がビタミンCにより還元されてTet活性に影響を及ぼした可能性までは否定できない。 さらに、Dicksonらは2-OGの主な供給源であるグルコースを培地に加え、Tet活性に対する2-OG要求性がビタミンCの有無で変動するかも調べた。 その結果、2-OGに関しても鉄と同様に、培地へのグルコース添加がTet活性に必須ではなかった。また、Tetおよびイソクエン酸から2-OGの産生を触媒する酵素、isocitrate dehydrogenase(IDH)の遺伝子発現にもビタミンCは影響を及ぼさなかった。

Yinらの報告

Yinら7)生体内でもビタミンCがTet活性を上昇させ、DNAの脱メチル化に関与するかをsfx/sfxマウスを用いて調べた。sfx/sfxマウスは、ビタミンC生合成経路のL-gulono-1,4-lactonから2-keto-L-gulono-1,4-lactoneの酸化反応を触媒するL-gulono-1,4-lactone oxidase(GULO)の遺伝子を人為的に破壊したマウスである。そのため、長期間ビタミンCを与えないと、壊血病様症状を呈して死に至る。 Yinら7)はこのマウスを用いて、肝臓、肺、大脳におけるDNAメチル化の変動を調べた。その結果、ビタミンCの欠乏により、肝臓、肺、大脳の5hmCレベルは有意に低値を示した。同時に、肝臓と大脳の5mCレベルは、ビタミンC投与群に比べて有意に高値を示した。これらの結果から、生体内でもビタミンCは5mCから5hmCへの変換を促し、DNA脱メチル化を介した様々な遺伝子発現に影響を及ぼす可能性が示唆された。 さらに脳では、他の臓器に比べて5hmCレベルが高値であること、またビタミンC濃度も高値であり、その保持能力も高いことが報告されている13)14)。これらのことから、DNAの脱メチル化は、脳で重要な働きをしており、ビタミンCは、Tet活性に必要不可欠である可能性を強く示唆している。

Blaschkeらの報告

Blaschkeら8)は、マウスES細胞を用いた研究から、ビタミンCがTet依存性のDNA脱メチル化を誘導し、blastocyst-like state(胚盤胞様)の遺伝子発現パターンを示すことを明らかにした。 Blaschkeらは、生殖細胞系で発現するDazl遺伝子の挙動に着目し、マウスES細胞を無血清培地で培養したとき、血清入りの培地では見られなかったDazl遺伝子の発現上昇を見出した。 そこで、無血清培地中のどのような成分がDazl遺伝子の発現上昇に関与するか、スクリーニングを行った。 その結果、ビタミンCがDazl遺伝子の発現を制御していることがわかった。 同様にDNA methyltransferaseの阻害剤、5-azacytidineでもビタミンCと同様のDazl遺伝子発現応答が見られたことから、ビタミンCは、DNAの脱メチル化を介して遺伝子発現に影響を及ぼしていると推察された。ここでもYinらの報告7)と同様に、ビタミンC添加によりDNAプロモーター領域の5mCの減少および5hmCの上昇がみられた。 また、Blaschkeらの報告8)では、さらにビタミンC添加に起因する5hmCレベルの上昇は一過性の可逆的反応であり、72時間後にはビタミンCを添加する前のレベルにまで減少した。同時に、一度低下した5mCレベルもビタミンCを培地から除去すると徐々に増加することがわかった。 Blaschkeらの報告8)でもGSH、DTTなどの還元性物質を添加して5hmCレベルの変動を見ているが、ビタミンC以外に5hmCレベルに影響を及ぼす物質はみつからなかった。 また、Tet1とTet2遺伝子を同時に欠損させたES細胞を用いて、ビタミンCによる5hmCレベルの上昇がTetを介していることも明らかにした。さらに、Blaschkeら8)はどのような遺伝子がビタミンCにより変動したかもマイクロアレイ解析により調べた。 その結果、ビタミンC添加により2倍以上の発現変動が見られた遺伝子は200程度あり、そのほとんどの遺伝子は、発現が上昇した。また、それら遺伝子の多くは、X染色体上に偏っていることもわかった。 Gene Ontology(GO)解析の結果、生殖細胞系の遺伝子群(Asz1, Wfdc15a, Dazl, Gtsf1)に変動が見られた。一方、多分化能(Oct4, Nanog)や分化(Gata4, Fgf5)に関連する遺伝子群は、ビタミンC添加による変動がほとんど見られなかった。 ビタミンC添加により上昇する生殖細胞系の遺伝子は、他の遺伝子よりも高度にメチル化されており、ビタミンC添加によりメチル化のレベルが低下することがわかった。 一方、その他の遺伝子は、ビタミンCによる脱メチル化が起こりにくいことから、別の遺伝子サイレンシング機構が存在することが示唆された。 近年、ES細胞の研究では、ES細胞とblastocyst(胚盤胞)のDNAメチル化状態の違いについて注目が集まっている。 Blaschkeらの報告8)でもDNAのメチル化が高度に出現するプロモーター領域のCpG アイランドのメチル化解析を行った結果、ビタミンC添加なしの培地で培養したES細胞は、胚盤胞に比べてCpG アイランドにおけるDNAのメチル化レベルが高いことがわかった。 ここで特に注目すべき点は、胚盤胞に比べてES細胞ではDNAのメチル化が高頻度の領域(主に生殖細胞系の遺伝子領域)では、ビタミンCによる脱メチル化が起こり易く、一方、メチル化の程度が胚盤胞と同等の領域(主にインプリンティング遺伝子やIntracisternal A particle(IAP)レトロエレメント)では、ビタミンCによる脱メチル化が起こり難いことである。 ビタミンCによる脱メチル化が起こり難いこれらの領域は、メチル化されたヒストンH3(H3K9me3)が高度に出現していることから、ヒストンのメチル化により、Tetを介したDNA脱メチル化に抵抗性を示しているのではないかと推察される。 さらに、胚盤胞で発現する遺伝子に着目したところ、通常ES細胞で発現がほとんど認められない遺伝子がビタミンC添加により、DNAメチル化の再構築が起こり、胚盤胞様の遺伝子発現パターンを示すようになった。 これらの結果から、Blaschkeら8)は、ES細胞においてビタミンCはTet活性を誘導することにより、DNAのメチル化パターンを再構築して、胚盤胞から胚盤葉上層への移行期における生殖細胞系の遺伝子群の発現を定常状態に戻す働きがあると結論付けている。

妊娠期間中、母胎のビタミンC欠乏により胎児に発生異常

私たちは、ビタミンC合成不全マウス(SMP30ノックアウトマウス)を用いて、妊娠期間中のビタミンC欠乏により、胎児に発生異常が生じることを明らかにした15)。 Blaschkeらの報告8)をはじめ、ビタミンCがTetを介してDNAの脱メチル化を促し、様々な遺伝子発現に影響を及ぼすことが明らかになった。そのため、母体のビタミンC欠乏により、発生初期にみられるDNA脱メチル化の異常が、胎生致死を招いた可能性も十分に考えられる。 近年、体外受精は増加の一途をたどる。新生児の約40人に1人が体外受精により生まれているともいわれているが、その成功率は40歳以上では1割以下ともいわれる。また、体外受精を施すことでエピジェネティクな変化を引き起こしているのではないかとの懸念もある。 こうした中で、ビタミンCによる脱メチル化が体外受精の成功率を改善できるのではないかと期待される。一方、Tetが急性骨髄性白血病関連の遺伝子転座から発見された経緯やTet1変異が様々ながんの発症に関連することから、ビタミンCによるTet活性の上昇がCpG アイランドの過剰なメチル化を伴うがんの治療に有効である可能性も示唆される。 実際、高濃度ビタミンC点滴療法ががんの治療に有効である報告もある。現在、高濃度ビタミンC点滴療法は、ビタミンCと鉄によるFenton反応の結果生じた過酸化水素による正常細胞とがん細胞での感受性の違いを利用した細胞傷害機構と考えられている。 今後、ビタミンCによる脱DNAメチル化ががん抑制に及ぼす影響も研究の対象になることが予想される。5mCが「第5の塩基」であるのに対して、「第6の塩基」とも呼ばれる5hmCの機能が、今後さらに明らかになっていくことで、生体機能をエピジェネティクスの観点から制御できる時代が来るかも知れない。


文 献

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